PRO-seq（Precision Nuclear Run-On Sequencing）技术，是一项能够以单碱基分辨率实时捕捉RNA聚合酶转录位置的革命性技术，可以掲示基因转录起始、暂停、延伸、终止等动态过程。它让我们能够“看见”转录的实时动态，是研究基因调控的强大工具。
PRO-seq是一种基于核运行实验（Nuclear Run-On）的高通量测序技术。它的核心原理是：在细胞核被分离并停止内源转录后，通过外源添加生物素标记的核苷酸（biotin-NTPs），让原本就结合在DNA上的RNA聚合酶继续延伸1个碱基，从而标记出每个聚合酶的精确转录位置。
1. 样本处理与细胞核分离：对细胞或组织样本进行预处理，分离完整细胞核，尽量保留取样时的转录复合物状态，为后续核 run-on 反应提供稳定起始材料。
2. 核运行反应（Nuclear Run-on）：在分离的细胞核中加入Biotin-NTPs，使正在延伸的 RNA polymerase 继续合成新生 RNA，并将标记核苷酸掺入 RNA 链中。
3. RNA 提取与片段化：反应结束后提取 RNA，并进行适当片段化处理，以便后续富集、建库和高分辨率定位。
4. 新生 RNA 富集：利用链霉亲和素特异性富集带有生物素标记的新生 RNA，去除未标记 RNA，提高目标信号比例。
5. 文库构建：对富集后的新生 RNA 进行接头连接、反转录和 PCR 扩增，构建适用于高通量测序的链特异性文库。
6. 高通量测序：对构建完成的文库进行高通量测序，获得全基因组范围的新生 RNA 序列信息。
7. 数据分析：将测序 reads 比对至参考基因组，生成正负链新生转录信号图谱，并开展转录活性、eRNA、启动子暂停、差异转录等分析。
1、转录活性分析：基于基因区域的新生 RNA 信号，评估不同样本或处理组之间的即时转录变化，筛选转录激活或抑制的基因，并进行差异分析、功能富集分析；
2、调控元件分析：通过检测基因间区的新生 RNA 信号，识别活跃调控元件，并分析不同处理组之间的表达差异；
3、转录动力学分析：分析 RNA polymerase 在基因体和终止区域的分布特征，评估暂停、暂停释放、转录延伸、终止以及共转录加工过程，揭示基因表达变化背后的转录动力学机制；
4、分子调控轴解析：筛选具有调控关系的转录因子-调控元件、调控元件-靶基因、转录因子-靶基因对，构建“调控元件—转录因子—靶基因”的候选调控关系网络，深入解析核内转录调控机制。
1. 区分直接和间接转录响应：PRO-seq 可直接检测正在发生的新生转录，适合用于观察处理后早期基因转录变化。相比普通 RNA-seq，PRO-seq 更能区分基因是否被立即转录激活/抑制
2. 增强子活性与 eRNA 检测：发现真正被激活的调控元件。活跃增强子常伴随 eRNA 产生，而 eRNA 通常丰度低、稳定性差、响应快，常规 RNA-seq 不易充分捕获。PRO-seq 可通过新生 RNA 信号识别处于活跃状态的增强子区域。
3. 转录动力学分析：暂停释放、延伸与终止。PRO-seq 可观察 RNA polymerase 在基因体和终止区域的分布，用于分析转录过程。
4. 转录调控机制解析。同时检测转录因子、调控元件、靶基因的基因表达，构建“转录因子—调控元件—靶基因”的转录调控网络，深入解析核内调控机制。
1. 覆盖更全面：同时解析增强子转录与基因转录
PRO-seq 检测新生 RNA，不局限于成熟 mRNA，可同时捕获基因本体转录信号和增强子区域产生的 eRNA 信号。对于转录调控研究而言，该技术不仅能回答“哪些基因被激活”，还能进一步追踪“哪些调控元件被激活”。
2. 去除稳态 RNA 干扰，识别直接转录效应
普通 RNA-seq 反映的是 RNA 合成、加工和降解后的稳态结果，容易受到 RNA 稳定性变化、转录后调控和继发效应影响。PRO-seq 直接检测正在发生的新生转录，更适合捕捉药物、刺激或基因扰动后的原发转录响应，帮助区分直接转录效应与间接表达变化。
3. 捕获瞬态响应，提升早期调控事件检测灵敏度
许多转录调控事件发生迅速且持续时间短，例如激素刺激、炎症因子处理、转录因子激活或药物干预后的早期响应。PRO-seq 可捕获瞬时产生的新生 RNA 信号，尤其适合发现常规 RNA-seq 中容易被稀释或遗漏的短暂转录变化。
4. 解析转录动力学过程
PRO-seq 可观察 RNA polymerase 增强子、基因体和终止区域的分布，适用于分析暂停释放、延伸、终止及共转录 RNA 加工等过程。该技术能够从“是否表达”进一步深入到“转录如何被调控”。
1. 实验流程自主研发，特殊提核方式有效捕获新生RNA。
2. 不限物种及组织类型，非模式物种执行经验丰富，已开展包括人，鼠，猴子、牛、拟南芥、小麦、芒果、油松、鱼、虾、贝等十余种动植物项目。
3. 分析体系完善，包含基因活性、调控元件、转录动力学以及三元调控网络，提供全面的分析结果与多组学联合应用分析。
4. 文章级全流程服务，包括一对一方案谈论及制定、检测数据解读、个性化分析、验证方案、审稿意见回复等。
a. 组织或细胞液氮速冻后干冰寄送。
b. 不同类型样本推荐送样量如下：
普通 RNA-seq 主要检测细胞中已经积累的 RNA，反映的是 RNA 合成和降解共同作用后的稳态水平。PRO-seq检测的是正在转录的新生RNA，更接近实时转录活性，适合研究直接转录响应和转录调控机制。
ChIP-seq 检测某个蛋白或组蛋白修饰在基因组上的结合位置，例如 Pol II、H3K27ac 或某个转录因子。PRO-seq 检测正在发生的转录活动。Pol II ChIP-seq 能看到 Pol II 是否结合在某个区域，但不一定能判断其是否正在有效延伸；PRO-seq 可以更直接反映 engaged polymerase 的转录输出。
chip-seq看到静态关联，有蛋白结合不代表活性状态；新生RNA直接检测活性状态。
可以。活跃增强子常产生短暂、低丰度、双向转录的 eRNA。PRO-seq 对新生 RNA 和不稳定 RNA 具有较高敏感性，适合用于识别活跃增强子，并可与 H3K27ac ChIP-seq、ATAC-seq 或 CUT&Tag 结果联合分析。
PRO-seq和GRO-seq均为核run on新生RNA测序技术，主要区别在于run on过程中使用的标记NTP不同，GRO-seq使用Br标记的UTP，而PRO-seq使用生物素标记的NTP；其次是GRO-seq进行run on后延伸50-100nt片段，而PRO-seq由于生物素位阻影响仅延伸1个nt，因此说PRO-seq是单碱基分辨率的新生RNA检测技术。
SLAM-seq 是基于 4sU 代谢标记，但它通常不依赖物理富集新生 RNA，而是通过化学反应让 4sU 标记的 RNA 在测序中产生 T-to-C 转换，从而在总 RNA 中区分新合成 RNA 和旧 RNA。
因此，SLAM-seq 更适合研究 RNA 生成和降解动力学，例如 RNA half-life、新旧 RNA 比例、转录后调控和单细胞转录动态等问题。它的优势是可以在同一份 RNA 群体中通过碱基转换识别新合成 RNA。
PRO-seq 则更偏向捕获正在延伸的 RNA polymerase 对应的新生转录信号，适合研究启动子、增强子、基因体和终止区域的即时转录活性。
简单理解：
PRO-seq 关注“RNA polymerase 正在何处转录”；
SLAM-seq 关注“哪些 RNA 是新合成的，以及新旧 RNA 如何变化”。
1.一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法。董志诚; 朱家富; 刘敏。中国专利：CN112680797A，2021-04-20。
2.Kwak H, Fuda N J, Core L J, Lis J T. Precise maps of RNA polymerase reveal how promoters direct initiation and pausing[J].Science,2013,339(6122):950-953.
