1. 什么是新生RNA？
新生 RNA（Nascent RNA）是基因转录过程中，RNA 聚合酶正在合成、尚未完成转录加工的 RNA 分子，主要结合在染色质上，代表细胞当下正在发生的转录活性。它区别于经过剪接、加帽加尾后释放到胞质的成熟 RNA，能够真实反映基因的实时转录状态。
2. 研究新生RNA 有什么用？
普通 RNA-seq 检测的是积累的成熟mRNA，是转录、RNA 加工、RNA 降解共同作用后的结果，无法区分转录水平与转录后水平的变化。 新生 RNA 测序直接捕获正在转录的 RNA，可以实现：
① 解析基因实时转录活性，区分转录调控与转录后降解带来的基因表达改变；
② 研究转录暂停、延伸、通读、转录终止等转录动力学事件；
③ 鉴定增强子转录产生的 eRNA，解析增强子-靶基因调控关系；
④ 挖掘转录共剪接、共转录修饰等早期 RNA 加工事件；
⑤ 解析转录因子、染色质状态如何直接调控基因转录起始与延伸。
3. 可以测出核内哪些类型的新生RNA？
新生 RNA 测序可以捕获核内正在转录的多种 RNA 类别，主要包含：
蛋白编码基因的未完成加工的前体 mRNA（pre-mRNA）；
增强子转录本 eRNA；
lncRNA（染色质结合型长非编码 RNA）；
反义转录本；
终止通读产生的延伸转录本；
其他正在转录的非编码 RNA。
4. 同一个基因的核RNA 可以测出哪些种类片段？
同一个基因位点的核新生 RNA，能够检测到多种转录片段：
1）转录起始后尚未完成延伸的 5’端片段；
2）包含完整内含子、外显子的未剪接 pre-mRNA 片段；
3）部分发生转录共剪接、部分内含子已经剪切的中间态转录片段；
4）转录通读产生的越过转录终止位点 TES 的 3’延伸片段；
5）该基因位点的反义链转录片段。
通过这些片段可以反映转录起始、延伸、剪接、终止的动态过程。
5. 新生RNA 与成熟RNA（mRNA）的核心区别是什么？
新生 RNA | 成熟 mRNA | |
转录阶段 | 转录正在进行，转录加工尚未完成 | 转录完成，经过完整 RNA 加工 |
主要定位 | 细胞核 | 细胞质 |
结构特征 | 保留大量内含子，无 / 不完全加帽加尾 | 去除内含子，完整 5’帽、3’polyA 尾 |
生物学含义 | 反映实时转录活性 | 反映细胞积累的稳态表达水平 |
受到哪些过程影响 | 主要受转录起始、延伸、终止调控 | 转录+剪接+核输出+RNA降解共同调控 |
6. 新生RNA 的半衰期一般有多长？这对实验设计有何影响？
绝大多数新生 RNA 半衰期很短，多数在数分钟级别；其中 pre-mRNA、eRNA 等不稳定转录本半衰期往往仅1-10 min，远短于成熟 mRNA（小时-天级别）。
对实验设计的影响：
样本稳定性极低：样本收集后要快速处理，严格避免降解，一旦发生 RNA 降解，新生 RNA 信号会快速丢失；Run on 类技术对细胞核活性要求更高；
代谢标记时间窗口窄：SLAM-seq/4sU-seq 等代谢标记技术，标记时间不能过长，过长会标记到大量已经加工成熟的 RNA，混入成熟 RNA 背景；标记过短，新生 RNA 产物不足，测序信号偏弱；
适合捕捉瞬时刺激、药物处理后的早期转录应答，适合处理后短时间点取样；不适合用来反映长时间稳态积累效应；
测序深度需求更高：新生 RNA 整体丰度低，需要更高测序深度获得足够有效 reads。
1. 新生RNA 研究方法有哪些？
目前主流新生 RNA 测序技术主要分为两大技术路线：细胞核 Run on 延伸法与体内代谢标记法。
1）Run on 延伸类：GRO-seq、PRO-seq，分离细胞核，体外让 RNA 聚合酶继续延伸新生转录本进行捕获；
2）代谢标记类：SLAM-seq（4sU 标记）、EU 标记测序，活细胞内掺入硫代尿苷标记新合成 RNA，再富集鉴定； 3）染色质结合 RNA 捕获类：CB RNA-seq，直接提取染色质结合的 RNA 获取新生转录本；
此外还有长读长新生 RNA 测序、单细胞新生 RNA 测序等衍生技术。
2. 新生RNA 测序与普通RNA-seq 有什么异同？
相同点：都对 RNA 进行测序，可以获得基因转录相关信息，都可以做基因表达分析。
不同点：
检测对象：新生 RNA 测序捕获正在合成的转录本，反映实时转录活性；普通 RNA-seq 检测细胞稳态积累的成熟 mRNA；
分子特征：新生 RNA 富含内含子、未终止通读片段、不稳定的eRNA；普通 mRNA 已经完成剪接、加尾；
生物学意义：新生 RNA 测序可区分转录调控与转录后降解效应、直接效应基因与间接效益基因；普通 RNA-seq 信号是转录、剪接、降解、核输出综合后的结果；
应用侧重：新生 RNA 测序适合研究转录动力学、eRNA、直接响应基因；普通 RNA-seq 多用于稳态下基因差异表达筛选。
3. 新生RNA 测序与ATAC-seq 有什么异同？
相同点：都可以研究基因转录激活相关调控，可联合解析染色质开放与转录活性。
不同点：
ATAC-seq：检测染色质开放区域，反映 DNA 层面的可及性，代表转录发生的潜在能力，不直接代表正在发生转录；
新生 RNA 测序：直接检测正在转录的 RNA 分子，反映真实正在发生的转录行为；
举例：部分开放的染色质区域不一定发生转录；而发生转录的区域，染色质通常处于开放状态。二者经常联合使用。
4. 新生RNA 测序与ChIP-seq 有什么异同？
相同点：都用于转录调控研究，经常联合分析转录因子、RNA 聚合酶、组蛋白修饰与转录活性的关联。
不同点
ChIP-seq：检测蛋白在基因组 DNA 上的结合位点（如 RNA 聚合酶、转录因子、组蛋白修饰），反映蛋白与 DNA 的相互作用；
新生 RNA 测序：检测转录产生的 RNA 产物，直接反映转录的输出结果；
ChIP-seq 看到转录因子结合，不代表一定基因转录；新生 RNA 可以直接读出实际转录输出。
5. 什么是run on 技术？
Run on（体外核延伸）是经典的新生 RNA 捕获技术。从细胞中分离完整细胞核，此时细胞内原有转录被终止，但结合在 DNA 上的 RNA 聚合酶仍停留在转录模板上。在外源提供核苷酸底物的体外体系中，让 RNA 聚合酶继续向前延伸，合成带有标记的新生 RNA，之后对新合成片段捕获测序，代表转录发生时 RNA 聚合酶真实的位置。GRO-seq、PRO-seq 都属于 Run on 技术。
6. GRO-seq、PRO-seq、CB RNA-seq、SLAM-seq 技术有什么异同？
GRO-seq：Run on 技术，捕获所有正在延伸的聚合酶的转录产物，分辨率中等，可以检测转录通读、eRNA；无法区分聚合酶精细位置。
PRO-seq：Run on 技术，利用核苷酸阻断，只捕获聚合酶 3’端末端，单碱基分辨率，精准定位 RNA 聚合酶的停留位置，适合计算暂停指数 PI。
CB RNA-seq：直接提取染色质结合 RNA，不做体外延伸、不做体内标记；捕获结合在染色质上的 RNA，包含新生转录本以及部分加工中间产物。
SLAM-seq：体内代谢标记，活细胞掺入 4sU 标记新合成 RNA，通过 T C 转换识别新生 RNA；无需分离细胞核，适合药物、刺激处理的活细胞样本。
技术 | 技术原理 | 优势 | 局限 |
GRO-seq | 体外Run On | 通量高，eRNA、转录动力学检测效果好 | 无法做到单碱基分辨率 |
PRO-seq | 体外Run On | 单碱基分辨率，适合聚合酶精准定位 | 需要完整活细胞核，样本门槛高 |
CB RNA-seq | 染色质RNA | 操作相对简单，无需标记，可用于共转录剪接研究 | 混杂部分加工后 RNA，背景偏高 |
SLAM-seq | 体内代谢标记 | 无需分离细胞核，适合活细胞处理；可用于分析RNA半衰期 | 实验存在 T C 转换假阳性；不能分析eRNA及转录动力学 |
7. 进行新生RNA 研究时，怎么选择合适技术？
如果需要单碱基分辨率研究 RNA 聚合酶暂停、停留：优先 PRO-seq；
如果重点研究 eRNA、转录通读、转录动力学：选择 GRO-seq、PRO-seq；
对转录起始位点进行精准定位、调控元件进行精准鉴定，选择PRO-cap、GRO-cap；
药物/刺激处理活细胞，不方便分离细胞核：优先SLAM-seq；
样本条件有限，难以制备高活性细胞核，可优先选择 CB RNA-seq；
研究共转录剪接，优先选择CB RNA-seq；
研究RNA周转降解，优先选择SLAM-seq；
组织样本：4sU难以均匀标记组织样本，植物细胞壁阻隔更难以进入植物细胞，不选SLAM-seq。
8. 代谢标记法（EU/4sU 标记）与run on 法（GRO/PRO-seq）的核心原理差异是什么？
Run on 法（GRO-seq/PRO-seq）：离体细胞核体系。细胞裂解提取细胞核，体内转录停止，让已经结合在 DNA 上的 RNA 聚合酶在体外继续延伸，捕获原本就启动的转录；不标记活细胞。
代谢标记法（4sU/SLAM-seq/EU）：活细胞内完成标记。向活细胞培养基加入标记核苷酸，细胞在体内转录时把标记分子掺入新合成 RNA，捕获标记时间窗口内新启动合成的 RNA。
核心差异：Run on 捕获细胞核内已经启动的转录；代谢标记捕获活细胞在标记时间段中新合成的 RNA。
9. 哪些样本类型可以做新生 RNA 测序？细胞、组织、原代细胞是否都支持？
细胞系：支持，是最常用样本；
原代细胞：支持，但原代细胞活性、细胞量需要满足实验要求；
动物组织：GRO-seq/PRO-seq支持，冻存组织也能做 Run on 类技术；SLAM-seq不支持，需要活细胞进行体内标记。
植物组织：GRO-seq/PRO-seq支持，冻存组织也能做 Run on 类技术；SLAM-seq不支持，需要活细胞进行体内标记。
不同技术对样本兼容性差异较大，正式实验前需要评估样本可行性。
10. 样本制备有哪些关键注意点？为什么新生RNA 对样本降解非常敏感？
样本制备关键注意点：
样本处理速度要快，尽量缩短离体后的操作时间；
严格抑制 RNA 酶污染；
Run on 系列必须保证细胞核完整、有生物活性；
代谢标记样本要严格控制标记时间，标记结束快速淬终止反应。
新生 RNA 大多是未被蛋白充分保护的转录中间产物，半衰期极短（数分钟级别），一旦发生降解，信号会快速丢失；成熟 mRNA 有蛋白保护更加稳定，而新生 RNA 没有完整蛋白保护，极易被 RNase 降解。
11. Run on 类技术（GRO/PRO-seq）是否必须活细胞核，冻存组织能不能做？
Run on 技术依赖有生物活性的细胞核，要求细胞核内 RNA 聚合酶保留延伸能力，冻存组织解冻后细胞核内RNA 聚合酶依然有延伸能力，适合 GRO-seq、PRO-seq；SLAM-seq需要活细胞进行体内标记，不适合冻存组织。
12. SLAM-seq 硫标记处理，药物标记时间如何设计？标记时间过长 / 过短会带来什么问题？
标记时间需要结合细胞类型、实验处理目的综合设计，常规细胞常用 30 min-2h 区间。
标记时间过短：新合成 RNA 总量少，有效标记 reads 不足，测序信噪比低；
标记时间过长：4sU 标记会掺入大量已经加工成熟的 RNA，新生 RNA 信号被成熟 RNA 背景掩盖，无法精准捕捉瞬时转录应答。
研究瞬时转录应答，尽量选择短标记时间；长时间标记会混淆新转录与稳态 RNA。
13. 生物学重复建议设置多少？
常规建议至少设置2-3 个生物学重复。新生 RNA 测序实验本身波动高于普通 RNA-seq，3 组生物学重复可以更好过滤实验噪声，保障差异分析可靠性；条件允许优先 3 个生物学重复。
14. GRO-seq 与PRO-seq 核心差异：核苷酸阻断的原理是什么？分辨率差异？
PRO-seq 在 Run on 反应体系中加入生物素标记核苷酸，RNA 聚合酶延伸一个碱基就会被终止（生物素分子较大阻碍进一步延伸），捕获 RNA 聚合酶的 3’末端，实现单碱基分辨率，精准定位聚合酶停留位置。 GRO-seq 没有链终止步骤（Br标记核苷酸分子较小不能阻止延伸），聚合酶可以长距离延伸，获得更长片段，适合检测通读、eRNA，但只能得到片段区间，没有单碱基分辨率。
15. SLAM-seq 化学标记的假阳性来源是什么？如何降低 T-C 转换假阳性？
假阳性来源：
RNA 本身固有 C-T 天然突变；
RNA 降解、RNA 损伤带来的随机 T-C 转换；
测序本身的碱基错误。
降低假阳性策略：
设置无 4sU 处理的阴性对照，统计本底 T-C 转换水平；
优化 4sU 给药浓度，避免过高浓度造成 RNA 损伤；
生物信息层面设置 T-C 转换数阈值过滤背景噪声。
16. CB RNA-seq 捕获的是哪一部分新生RNA，和Run on 体系本质区别？
CB RNA-seq 捕获与染色质紧密结合的 RNA，包含正在转录的新生 RNA，同时混杂部分尚未解离的转录加工中间产物。 和 Run on 本质区别：CB RNA-seq 不做体外延伸，也不做体内化学标记，直接提取染色质结合 RNA；Run on 是体外让聚合酶继续合成新片段，信号来自体外延伸产生的 RNA。CB RNA-seq 实验操作简单，但背景信号高于 Run on 技术。
17. 新生RNA 测序技术各自的局限性是什么，哪些场景不适合使用？
GRO-seq / PRO-seq：必须新鲜活性细胞核，不适合无法制备完整细胞核的样本。
SLAM-seq：需要活细胞给药标记；固定样本、离体细胞核样本无法做；存在 T-C 转换假阳性；药物浓度会存在细胞毒性风险。
CB RNA-seq：无法完全剔除部分加工后 RNA，背景较高，不适合高精度聚合酶定位分析。
所有新生 RNA 测序，均不适合单纯做稳态基因表达量筛选，更适合转录动力学、调控事件解析。
18. 长读长测序（Nanopore/PacBio）在新生RNA 研究中的有哪些应用？
长读长可以获得完整新生 RNA 全长片段，弥补短读长测序的缺陷，主要应用：
直接识别完整未剪接的新生转录本，解析转录共剪接动态；
直接鉴定转录通读事件，确定通读的完整转录产物；
直接检测 RNA 共转录修饰；
识别复杂基因位点的多种新生转录本异构体。
缺点：测序成本高，通量相比短读长更低。
19. 单细胞新生RNA 测序与常规新生RNA 测序有何不同？
常规新生 RNA 测序是批量细胞水平，得到群体细胞的平均转录信号； 单细胞新生 RNA 测序可以解析单个细胞层面的新生转录活性，可以解析细胞异质性、转录爆发（transcriptional bursting），分辨不同细胞亚群的实时转录状态。
局限：单细胞新生 RNA 测序技术难度大，每个细胞捕获的新生 RNA 分子数少，信噪比低于批量新生 RNA 测序，成本较高。
1. 什么是转录水平调控与转录后水平调控？
转录水平调控：发生在基因转录生成 RNA 的过程，调控转录起始、延伸、终止，直接决定新生 RNA 的合成量，可通过新生 RNA 测序直接捕获。例如转录因子调控 RNA 聚合酶招募、启动子近端暂停释放。
转录后水平调控：转录完成之后发生的调控，包括 RNA 剪接、RNA 修饰、核输出、RNA 降解等，不改变新生 RNA 的合成，但会改变成熟 mRNA 的稳态丰度。
普通 RNA-seq 得到的表达变化，是转录水平与转录后水平调控叠加的结果；新生 RNA 测序可以把二者分离开。
2. 什么是直接效应基因（靶基因）和间接效应基因（靶基因）？
直接效应基因：处理 / 扰动后，转录因子或信号分子直接作用于该基因位点，使其新生 RNA 合成立刻发生改变，转录层面直接响应扰动，可被新生 RNA 测序早期捕获。
间接效应基因：不是扰动的直接作用对象，是下游信号通路、转录级联反应带来的二次改变。该类基因变化发生时间更晚，是其他基因调控后的结果。
借助新生 RNA 早期时间点的转录信号，可区分直接靶基因与间接靶基因，排除转录后、次级信号带来的干扰。
3. 什么是转录动力学，包括哪些步骤？
转录动力学描述 RNA 聚合酶从结合基因到完成转录全过程的动态速率行为。 主要步骤包含：转录起始、启动子近端暂停、暂停释放、转录延伸、转录终止、RNA 释放。 新生 RNA 测序可以定量每一步的动态变化，解析扰动具体影响转录的哪一个环节。
4. 什么是TSS 和TES？
TSS（Transcription Start Site，转录起始位点）：基因开始转录的基因组位置，RNA 聚合酶从此处启动 RNA 合成。
TES（Transcription End Site，转录终止位点）：转录终止的基因组位置，正常情况下 RNA 聚合酶运行至 TES 附近停止转录。 新生 RNA 测序可以精准识别实际的 TSS、TES，区别于注释文件的参考位点。
5. 什么是启动子近端暂停？
启动子近端暂停是真核细胞中普遍存在的转录调控模式。RNA 聚合酶 Ⅱ 完成转录起始，合成一小段 RNA 后，在 TSS 下游几十碱基位置短暂停滞，不继续向前延伸，形成暂停状态。 聚合酶需要接受信号发生释放，才会进入高效延伸阶段；该步骤是很多基因快速激活/抑制的关键调控节点。
6. 什么是暂停指数PI？如何计算，PI 高 / 低分别代表什么？PI 值的过滤标准怎么定？
暂停指数 PI（Pausing Index），用于定量评估启动子近端暂停的强弱，是新生 RNA 测序核心指标。
计算逻辑：启动子近端区域（TSS±150bp）的read计数/基因主体延伸区的read计数。
PI 高：大量 RNA 聚合酶停滞在启动子附近，延伸效率低，基因处于暂停状态；受到信号刺激后可发生释放，快速激活转录。
PI 低：聚合酶较少发生近端暂停，顺利进入延伸阶段，基因处于活跃延伸状态。
根据目前研究，一般将PI≥3.0定义为暂停，PI＜3.0定义为非暂停。
7. 什么是基因通读？
基因通读（Transcription Read through）：RNA 聚合酶运行至 TES 转录终止位点后，没有正常终止，继续向下游 DNA 持续转录，越过终止位点产生超长的通读转录本。 通读属于转录终止缺陷，可影响下游基因表达，在胁迫、药物处理、疾病模型中高频出现。
8. 基因通读怎么定量，通读事件判定标准是什么？
定量思路：统计 TES 下游延伸区域的测序 reads 信号，与基因本体区域 reads 做比值，得到通读水平。 判定标准：
基因本体要有足够转录 reads，排除本底噪声；
TES 下游显著富集连续的转录信号；
处理组与对照组相比，下游信号比值显著上调。
9. 如何区分真实转录通读和3’端测序噪声？
看信号连续性：真实通读在 TES 下游呈现连续成片的 reads；噪声一般是零散、孤立的少数 reads。
本底对照：用对照组样本评估基因组该位点的本底背景水平，处理组显著高于对照才判定为通读事件。
排除注释来源：排除下游相邻基因本身转录带来的信号干扰。
链特异性：通读信号必须和基因本身转录链保持一致。
10. 什么是转录状态？基因转录状态怎么区分？基因转录状态变化有什么生物学意义？
根据基因在启动子近端暂停（暂停、非暂停）和基因体区域转录活性（活跃、非活跃）将基因转录状态分为4类：Type I（活跃、非暂停），Type II（活跃、暂停），Type III（非活跃、暂停），TypeIV（非活跃、非暂停）
基因转录状态切换是细胞快速响应外界刺激的重要手段。例如应激基因在细胞正常状态下一般处于Type III（准备状态），受到外界刺激后会立刻释放暂停状态的转录本快速合成应激基因RNA，应对外界刺激。
11. 转录终止的机制是什么？新生RNA 如何揭示终止调控？
真核转录终止主要依赖 polyA 信号识别，RNA 聚合酶识别 polyA 位点后发生转录终止，RNA 发生切割加 polyA 尾。 新生 RNA 测序可以直接观测终止异常现象：
TES 位置的转录信号衰减情况；
检测基因通读事件；
观察终止位点的偏移，识别可变终止。
12. 什么是转录爆发（transcriptional bursting）？
转录爆发（transcriptional bursting）：基因转录不是持续恒定输出，而是呈现间歇式脉冲开启与关闭。一段时间内大量 RNA 聚合酶集中启动转录，之后进入静默期，表现为细胞群体内部的转录异质性。 批量新生 RNA 测序可以观测群体平均结果；单细胞新生 RNA 测序更适合解析转录爆发行为。
13. 什么是转录共剪接？新生RNA 能不能做差异可变剪接分析？有哪些难点？
转录共剪接：RNA 还在转录延伸过程中，尚未完成全长转录，就已经发生内含子剪接，是细胞核内早期 RNA 加工方式。新生 RNA 测序可以捕捉这种部分剪接的中间转录本。
新生 RNA可以开展差异可变剪接分析，但存在明显难点：
新生 RNA 含有大量未剪接 pre-mRNA，内含子 reads 背景高；
部分可变剪接发生在转录后阶段，不在新生 RNA 上体现；
短读长测序很难完整区分不同转录本异构体；长读长新生 RNA 在可变剪接分析上更有优势。
14. 什么是可变剪接，有哪些类型？
可变剪接：同一个基因的 pre-mRNA，通过选择不同剪接位点，产生多种不同成熟转录本，扩大蛋白组多样性。 主要类型：A3SS（Alternative 3' Splice Site，可变3'剪接位点）、A5SS（Alternative 5' Splice Site，可变5'剪接位点）、ES（Exon Skip / Exon Skipping，外显子跳跃）、RI（Retained Intron，内含子保留）。
15. PIR（内含子保留率）计算逻辑，PIR 高低代表什么生物学含义？
PIR（Percent Intron Retention，内含子保留率），用于衡量内含子保留的程度。
计算逻辑：该内含子保留的 reads 数/（内含子保留 reads + 该内含子被剪接去除的 reads）。
PIR 高：内含子大量保留，剪接效率低；
PIR 低：内含子被高效剪接去除。
利用新生 RNA 的 PIR 可以反映转录共剪接的效率，注意区分核内新生 RNA 与细胞质成熟 mRNA 的内含子保留。
16. 新生RNA 怎么定量基因的新生转录本丰度，能否直接用普通RNA-seq 的count 流程？
新生转录本丰度，统计基因区间内属于新生 RNA 的有效 reads 数量。 不建议直接照搬普通 RNA-seq count 流程： 普通 RNA-seq 主要统计外显子 reads；新生 RNA 包含大量内含子、通读片段，需要统计基因全长（包含内含子）的 reads；同时要做链特异性处理，区分正义、反义转录本，需要适配新生 RNA 的专用分析流程。
17. 为什么新生RNA 差异基因和普通mRNA-seq 差异基因结果不一致？结果冲突该如何解释？
两者检测对象不同，结果不一致属于常见现象。
· 新生 RNA 反映RNA合成速率（转录层面）；
· mRNA-seq 反映成熟mRNA 稳态积累，受转录、剪接、RNA 降解多重调控。
冲突常见解释：
转录水平上调，但mRNA 被大量降解，mRNA-seq 看不到上调；
转录层面没有变化，但mRNA 降解速率改变，造成 mRNA-seq 出现差异；
时间窗口不同：新生 RNA 可以捕捉早期瞬时转录应答，mRNA 积累存在时间延迟。
18. 如何区分基因变化来自转录调控、转录后降解的贡献？
新生 RNA 测序信号变化 → 代表转录合成层面发生改变；
成熟 mRNA（普通 RNA-seq）发生变化，但新生 RNA 无明显改变 → 变化主要来自转录后调控，多为 RNA 降解、核输出等环节；
两者同时发生变化，说明转录与转录后调控共同参与。
19. 如何从新生RNA 数据挖掘转录暂停、释放、终止缺陷事件？
转录暂停 / 释放：计算 PI 暂停指数，对比处理组与对照组 PI 变化；PI 升高代表暂停增强；PI 下降提示发生暂停释放。
转录延伸异常：分析基因上 reads 沿基因长度的分布，看延伸信号是否均匀。
终止缺陷（通读）：统计 TES 下游转录信号，鉴定通读事件，评估终止效率。
1. 什么是eRNA？
eRNA（enhancer RNA，增强子 RNA），是增强子区域发生转录产生的非编码 RNA。增强子被激活时，RNA 聚合酶结合到增强子区域启动转录，生成 eRNA。 eRNA 大多半衰期很短，丰度低，主要定位于细胞核；普通 mRNA-seq 很难有效捕获，新生 RNA 测序是鉴定 eRNA 的核心手段。eRNA 的转录信号可以作为增强子活性的直接分子证据，提示该增强子处于激活状态。
2. 怎么使用新生RNA 进行eRNA 鉴定？
新生 RNA 测序可以捕获增强子区域正在转录的 RNA 信号，以此鉴定活跃的 eRNA，整体流程如下：
依据基因组注释或者 ATAC-seq、H3K27ac 信号，预先获得候选增强子区间；
在候选增强子区域统计新生 RNA 测序的链特异性 reads，识别有转录信号的区域；
结合转录本特征过滤，剔除蛋白编码基因、lncRNA 等其他转录本干扰；
根据链的转录模式区分单向 eRNA、双向 eRNA，最终得到高可信度 eRNA 集合。
GRO-seq、PRO-seq 数据对 eRNA 检测效果表现突出。
3. eRNA 鉴定有哪些过滤条件，如何减少假阳性eRNA？
常见过滤条件，用于降低假阳性：
信号过滤：候选增强子区域要有显著的新生 RNA reads 富集，排除测序背景噪声；
距离过滤：剔除邻近蛋白编码基因启动子、TSS 附近的转录信号，排除基因本体转录干扰；
注释过滤：去除与已知编码基因、lncRNA、重复序列重叠的区域；
链特异性校验：依靠链特异性测序，区分真实 eRNA 转录与 DNA 链的随机背景；
对照组校验：对比对照组样本，过滤在各组均无差异的本底转录噪音。
仅依靠基因组区间预测增强子会产生大量假阳性，必须结合新生 RNA 的转录信号，证明该位点真实发生转录，才判定为活跃eRNA。
4. 单向eRNA 与双向eRNA 有什么异同？
双向 eRNA：增强子区域正负两条链同时发生转录，向两侧生成短的非编码转录本，是增强子最经典的转录模式；多数激活的增强子产生双向 eRNA。
单向 eRNA：仅其中一条链发生转录，另一条链几乎无转录信号，转录产物往往更长。
相同点：二者均由激活的增强子转录生成，均可指示增强子活性。
差异点：双向 eRNA 是增强子的典型特征；单向 eRNA 需要注意区分是否为邻近基因的延伸转录噪声，需要严格过滤。
在动物中双向eRNA普遍，在植物中双向eRNA较少主要是单向eRNA。
5. 什么是增强子的靶基因？
增强子是远端顺式调控元件，不直接编码蛋白，通过染色质环空间接触，作用于远端的基因启动子，调控该基因的转录活性，被增强子调控的基因，就是增强子的靶基因。
增强子与靶基因不一定是距离最近的基因，依靠线性基因组距离判断容易出错；新生 RNA 可辅助判断增强子激活后哪些基因转录活性同步发生变化。
6. 什么是 “转录因子— 增强子—靶基因” 调控网络？
这是真核细胞重要的基因表达调控模型：
转录因子结合在增强子区域；
激活增强子发生转录产生 eRNA；
通过染色质空间互作，增强子接触靶基因的启动子；
调控 RNA 聚合酶活性，改变靶基因的转录水平。
把多个转录因子、对应的增强子、以及受调控的靶基因整合，就构成转录因子-增强子-靶基因调控网络，用来解析扰动条件下的基因表达调控逻辑。新生 RNA 测序提供 eRNA 与靶基因实时转录活性，是构建该网络的关键数据。
7. 调控网络分析部分可以分析哪些内容？
识别扰动处理后活性发生改变的增强子（基于 eRNA 转录信号）；
预测增强子对应的候选靶基因；
挖掘潜在结合增强子的转录因子，识别关键调控转录因子；
构建 “转录因子-增强子-靶基因” 的调控关系；
筛选核心枢纽增强子、核心枢纽转录因子；
结合靶基因功能富集，解析下游参与的生物学通路；
对比对照组与处理组，解析扰动前后调控网络的重编程变化。
8. 如何利用新生RNA 数据建立增强子-靶基因调控关系？有哪些主流算法与策略？
仅依靠基因组线性距离可靠性差，新生 RNA 提供转录活性信息，常结合多种策略联合预测：
转录活性相关性策略：eRNA 的转录水平变化，和候选靶基因的新生 RNA 转录丰度变化显著相关，提示二者存在调控关联；该策略只依赖新生 RNA 数据，使用最为广泛。
多组学联合策略：结合 ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq 确定增强子区间；结合 Hi-C/ChIA-PET 等3D 基因组数据，获取染色质空间互作证据，验证增强子和靶基因的物理接触。
主流分析工具 / 算法：如 ABC model、Target Finder 等，整合信号相关性、基因组距离、染色质互作信号打分，输出增强子-靶基因的置信关系。
提示：计算得到的是预测调控关系；关键位点建议后续开展分子实验进一步验证。
1. 新生RNA 测序如何与ChIP-seq 联合分析转录因子结合与转录活性的关系？
ChIP-seq 检测转录因子、RNA 聚合酶、组蛋白修饰在基因组 DNA 上的结合位置；新生 RNA 测序直接反映位点真实的转录输出，二者联合可以区分 “蛋白结合” 和 “实际转录激活”。
常用分析思路：
将转录因子 ChIP-seq 峰与新生 RNA 转录信号做交集，区分两类结合位点：有转录输出的功能性结合位点，以及仅有蛋白结合但无转录活性的非功能性结合位点；
对比处理前后，转录因子结合峰的强弱变化与对应基因新生 RNA 丰度变化，判断该转录因子是激活还是抑制靶基因转录；
结合 RNA 聚合酶 Pol Ⅱ 的 ChIP-seq，与新生 RNA 数据共同解析启动子近端暂停：Pol Ⅱ 结合信号结合 PI 暂停指数，判断扰动是影响聚合酶招募，还是影响暂停释放与延伸；
在增强子区域，将转录因子 ChIP 峰与 eRNA 转录信号关联，判断哪些增强子受该转录因子调控并真实发生转录。
提示：仅 ChIP-seq 看到蛋白结合，不代表下游一定发生转录；搭配新生 RNA 数据可以过滤大量无功能结合背景。
2. 新生RNA 测序如何与ATAC-seq 联合分析染色质可及性与新生转录的关系？
ATAC-seq 检测染色质开放区域，代表DNA 具备被调控蛋白结合的潜在能力；新生 RNA 测序检测真实发生的转录行为。二者联合可以解析 “染色质开放是否直接带来转录激活”。
常用分析思路：
整合两组数据，把区域分为四种状态：染色质开放且有转录、开放但无转录、关闭但低水平转录、关闭无转录；识别开放但不转录的 “潜伏开放区域”；
扰动处理后，对比开放区域的变化和对应位点新生 RNA（基因、eRNA）的变化：区分是先打开染色质再启动转录，还是转录发生不需要染色质发生显著改变；
筛选活跃增强子：ATAC-seq 给出候选增强子区间，新生 RNA 检测 eRNA 转录信号，筛选真正有转录活性的功能增强子，过滤大量单纯开放但不转录的候选区间；
关联基因层面：启动子区域染色质可及性变化，与该基因新生 RNA 合成水平联动，判断基因转录改变是否由染色质开放程度驱动。
3. 新生RNA 测序如何与 Hi-C 等 3D 基因组技术联合构建三维调控网络？
Hi-C、ChIA-PET 捕捉基因组空间染色质环互作，获得增强子与启动子之间的物理接触证据；新生 RNA 提供 eRNA 活性、靶基因实时转录变化，解决仅靠线性距离预测增强子 靶基因的缺陷。
常用分析思路：
利用 Hi-C 得到的染色质互作，筛选与基因启动子存在空间接触的增强子；再结合新生 RNA 中 eRNA 与靶基因转录活性的相关性，筛选高置信的增强子 靶基因对；
扰动处理后，对比：增强子 eRNA 活性变化、空间环是否改变、靶基因新生转录水平是否同步变化，区分两种调控模式：①原有染色质环不变，依靠增强子活性改变调控靶基因；②染色质环发生重构，带来转录改变；
构建三维 “转录因子-增强子-靶基因” 调控网络：3D 基因组提供物理连接，新生 RNA 提供转录活性证据，整合得到空间维度的调控网络；
识别远端疾病 / 变异位点：变异所在增强子通过染色质环接触哪些靶基因，再结合新生 RNA 判断靶基因转录是否受影响。
注意：Hi-C 证明物理接触，新生 RNA 证明转录活性，二者结合可以大幅降低调控关系预测的假阳性。
4. 新生RNA 测序如何与 m⁶A MeRIP-seq 联合研究共转录 RNA 修饰？
m⁶A 是最常见的 RNA 甲基化修饰，很多 m⁶A 修饰发生在转录过程中，即共转录修饰；普通 MeRIP-seq 捕获的是成熟 mRNA 的修饰，难以区分修饰发生在转录阶段还是转录后阶段。新生 RNA 测序可以捕获细胞核内未完成加工的转录本，用于解析共转录修饰。
常用分析思路：
将 MeRIP-seq 的 m⁶A 修饰峰与新生 RNA 转录本进行交集，筛选出存在于新生 pre-RNA 上的 m⁶A 位点，代表共转录水平发生的修饰；只出现在成熟 mRNA 的修饰，代表转录后才加上的修饰；
对比扰动条件下，新生 RNA 的转录水平变化和 m⁶A 修饰丰度变化，区分：基因转录合成改变带来的修饰丰度变化，和单纯修饰酶活性改变带来的修饰变化；
结合转录共剪接事件，分析 m⁶A 共转录修饰与内含子剪接效率（PIR）的关联，研究修饰如何影响早期 RNA 加工；
对于 eRNA、lncRNA 等不稳定转录本，MeRIP-seq 很难捕获，搭配新生 RNA 可以识别这类非编码 RNA 上的共转录 m⁶A 修饰。
提示：共转录修饰分析对样本质量要求高，新生 RNA 需要保证较高内含子 reads 占比，减少成熟 RNA 的污染干扰。
5. 新生 RNA 测序如何与 RNA-seq 联合分析？
新生 RNA 测序检测实时转录合成速率（细胞核内正在合成的 RNA）；常规 RNA-seq 检测细胞内稳态成熟 mRNA 积累量，是转录、剪接、核输出、RNA 降解共同作用的结果。两套数据联合，核心价值就是把转录水平调控和转录后水平调控分离开，解析基因表达变化的真实来源。核心分析思路：
1）区分扰动下基因表达的调控来源
新生 RNA 上调，同时 RNA-seq 也上调：基因变化主要来自转录合成增强；
新生 RNA 无显著变化，但 RNA-seq 显著上调 / 下调：转录合成没有改变，变化来源于转录后调控（mRNA 降解、核输出、剪接改变）；
新生 RNA 变化，RNA-seq 无变化：转录合成发生改变，但被转录后降解等机制抵消，稳态 mRNA 看不出差异，只看普通 RNA-seq 会完全漏掉该类响应基因。
2）区分直接靶基因与间接靶基因
药物 / 刺激早期时间点：新生 RNA 发生显著改变，而 RNA-seq 尚未出现变化，这类基因为直接响应的靶基因； RNA-seq 后期才出现差异、新生 RNA 无早期应答，多属于信号级联带来的间接次级响应基因。
3）解析 RNA 加工动态（剪接、内含子保留）
新生 RNA 数据计算 PIR（内含子保留率），反映转录共剪接效率；
普通 RNA-seq 的 PIR 反映细胞质成熟 mRNA 的内含子保留；
两者对比，可以判断内含子保留发生在转录阶段（细胞核），还是后续细胞质阶段。
4）研究转录本的时间动力学应答
新生 RNA 信号出现更早；成熟 mRNA 存在积累延迟。通过多时间点联合两套数据，可以拟合：转录合成速率、mRNA 积累、mRNA 降解的动态过程。
5）增强子eRNA 与靶基因的联合校验
新生 RNA 得到 eRNA 活性变化；RNA-seq 看下游基因稳态表达。
eRNA 发生变化，但 mRNA 无变化：提示增强子转录激活，但还未转化为成熟 mRNA 输出；或存在转录后缓冲机制。
6. 新生 RNA 如何与组蛋白修饰 ChIP-seq 联合分析调控元件？
组蛋白修饰 ChIP-seq 标记基因组上调控元件的染色质状态：H3K4me1 标记增强子候选区域，H3K27ac 代表元件激活状态；H3K4me3 标记活跃启动子；H3K27me3 代表抑制沉默区域PMC。 组蛋白修饰仅反映染色质表观状态，不能直接证明该元件正在发生转录；新生 RNA 测序检测元件真实转录信号（eRNA、启动子转录），二者联合可以区分 “有表观标记但无转录” 和 “真正发挥功能的调控元件”，大幅降低调控元件预测的假阳性。核心分析思路：
1） 区分候选增强子与真实活跃增强子
H3K4me1+H3K27ac ChIP-seq 得到全基因组候选活性增强子区间；很多候选增强子仅有表观标记，但并不转录。
叠加新生 RNA 测序，筛选出同时产生 eRNA 转录信号的区间，即为转录层面激活的功能性增强子；过滤只有 H3K27ac 富集、无 eRNA 转录的潜伏候选增强子。
区分待命增强子（H3K4me1 富集、缺少 H3K27ac，无 eRNA 转录）与激活增强子（H3K27ac 升高、产生 eRNA）。
2） 解析扰动处理下调控元件的激活时序
对比处理前后：组蛋白修饰信号变化与 eRNA（新生 RNA）转录变化。
模式 1：H3K27ac 升高，同时 eRNA 新生转录同步上调：增强子发生真正激活；
模式 2：H3K27ac 发生改变，但无 eRNA 转录变化：染色质表观发生改变，但尚未启动转录；
提示：表观标记改变不一定立刻带来转录输出，新生 RNA 可以捕捉转录层面的真实响应。
3）启动子区域联合解析转录调控状态
H3K4me3 标记活跃启动子，结合新生 RNA 的 PI 暂停指数：
H3K4me3 强富集 + 高 PI：启动子处于暂停待命状态，聚合酶停留，等待信号释放；
H3K4me3 强富集 + 低 PI：启动子处于高效活跃延伸状态。
H3K27me3 抑制标记富集，同时新生 RNA 几乎无信号：基因位点表观沉默，转录完全关闭。
4）基因本体组蛋白修饰与转录动力学关联
H3K36me3 标记基因编码区延伸区域。将 H3K36me3 信号分布与新生 RNA reads 沿基因的分布做关联，评估转录延伸效率；识别转录延伸受阻、提前终止的基因。
5）构建高置信 “增强子-靶基因” 调控对
由 ChIP-seq 确定增强子表观区间；
新生 RNA 获得 eRNA 转录变化，以及靶基因的新生转录活性；
将增强子的组蛋白修饰动态、eRNA 转录动态、靶基因新生 RNA 变化三者做相关性；
只有表观标记改变、eRNA 转录改变、靶基因转录改变三者协同变化，才判定为高置信调控关系。
