技术简介

CB RNA-seq（Chromatin-bound RNA sequencing）是一种通过提取并测序与染色质紧密结合的RNA分子，来捕获新生RNA 的高通量测序技术，人类体系一般命名为 chromatin‑associated RNA‑seq（caRNA‑seq / CAR‑seq）。CB RNA-seq广泛用于检测新生RNA的转录活性、共转录剪接事件，分析剪接中间体和套索结构，以及通过RNA聚合酶II定位分析转录暂停、转录终止等动力学过程。

实验原理及流程

转录起始后，RNA聚合酶II（Pol II）、DNA模板和新生RNA能形成稳定的三元复合物，该复合物能够抵抗非离子型表面活性剂和尿素的溶解作用。利用此特性，CB RNA-seq采用下列方法进行检测：

1.细胞核提取：先从组织或细胞中粗提取细胞核，然后用含有尿素的缓冲液进行洗涤，以破坏细胞核结构以及去除非染色质结合的RNA或蛋白质。

2.新生RNA纯化：再次用含有尿素的缓冲液进行洗涤，离心后去除上清液，获得富含Pol II 结合的新生RNA的沉淀。将沉淀重悬后对RNA进行提取，并用RiboPool oligo探针和oligo d(T) 探针基于磁珠的杂交捕获法去除rRNA和含有Poly尾的前体RNA。

3.高通量测序：对纯化后的新生RNA进行建库和测序。

分析内容

1、转录活性分析：基于基因区域的新生 RNA 信号，评估不同样本或处理组之间的即时转录变化，筛选转录激活或抑制的基因，并进行差异分析、功能富集分析；

2、调控元件分析：通过检测基因间区的新生 RNA 信号，识别活跃调控元件，并分析不同处理组之间的表达差异；

3、转录剪接分析：分析 新生RNA序列的5’端信号、3’端信号，鉴定剪接位点、内含子保留率、可变剪接事件，揭示基因表达变化背后的共转录剪接机制；

4、分子调控轴解析：筛选具有调控关系的转录因子-调控元件、调控元件-靶基因、转录因子-靶基因对，构建“调控元件—转录因子—靶基因”的候选调控关系网络，深入解析核内转录调控机制。

主要应用方向

1. 区分直接和间接转录响应：CB RNA-seq 可直接检测正在发生的新生转录，适合用于观察处理后早期基因转录变化。相比普通 RNA-seq，CB RNA-seq 更能区分基因是否被立即转录激活/抑制

2. 增强子活性与 eRNA 检测：发现真正被激活的调控元件。活跃增强子常伴随 eRNA 产生，而 eRNA 通常丰度低、稳定性差、响应快，常规 RNA-seq 不易充分捕获。CB RNA-seq 可通过新生 RNA 信号识别处于活跃状态的增强子区域。

3. 共转录剪接分析：剪接位点、内含子保留率、可变剪接事件。CB RNA-seq 可观察 RNA序列在基因体的分布，用于分析转录剪接过程。

4. 转录调控机制解析。同时检测转录因子、调控元件、靶基因的基因表达，构建“转录因子—调控元件—靶基因”的转录调控网络，深入解析核内调控机制。

技术优势

1. 覆盖更全面：同时解析增强子转录与基因转录

CB RNA-seq 检测新生 RNA，不局限于成熟 mRNA，可同时捕获基因本体转录信号和增强子区域产生的 eRNA 信号。对于转录调控研究而言，该技术不仅能回答“哪些基因被激活”，还能进一步追踪“哪些调控元件被激活”。

2. 去除稳态 RNA 干扰，识别直接转录效应

普通 RNA-seq 反映的是 RNA 合成、加工和降解后的稳态结果，容易受到 RNA 稳定性变化、转录后调控和继发效应影响。CB RNA-seq 直接检测正在发生的新生转录，更适合捕捉药物、刺激或基因扰动后的原发转录响应，帮助区分直接转录效应与间接表达变化。

3. 捕获瞬态响应，提升早期调控事件检测灵敏度

许多转录调控事件发生迅速且持续时间短，例如激素刺激、炎症因子处理、转录因子激活或药物干预后的早期响应。CB RNA-seq 可捕获瞬时产生的新生 RNA 信号，尤其适合发现常规 RNA-seq 中容易被稀释或遗漏的短暂转录变化。

4. 解析共转录剪接过程

CB RNA-seq 可观察 RNA 序列在基因体的分布，适用于分析剪接位点、内含子保留率、可变剪接事件，从源头上区分剪接是发生在转录过程中还是转录后。

深碳优势

送样建议

常见问题FAQ

Q1：CB RNA‑seq 和普通 RNA‑seq 有什么区别？

普通 RNA‑seq 提取细胞总 RNA，检测的是已经释放、积累在细胞内的成熟 RNA，反映RNA 合成与降解平衡后的稳态表达水平，大量成熟 mRNA 会掩盖早期转录信号。 CB RNA‑seq 富集染色质上结合的 RNA，主要捕获刚转录出来、还锚定在染色质上的新生 RNA、未完成剪接的前体 RNA，能观察转录起始、共转录剪接事件，更贴近转录发生的真实过程，不受胞质成熟 RNA 丰度干扰。

Q2：CB RNA‑seq 和 GRO‑seq 有什么区别？

GRO‑seq 基于细胞核体外 run‑on 反应，让已经结合在 DNA 上的 RNA 聚合酶在体外继续延伸，掺入标记核苷酸，捕获实验瞬间正在延伸的聚合酶对应的新生 RNA，可以精准反映实时聚合酶活性、启动子暂停、eRNA。 CB RNA‑seq 不做体外转录延伸，直接分离染色质，提取上面结合的内源 RNA；得到的是细胞内真实存在的染色质锚定转录本，包含新合成 RNA 以及共转录加工中间体。 

简单理解： 

GRO‑seq：测此刻聚合酶正在体外继续转录的信号；

CB RNA‑seq：测细胞内真实挂在染色质上的内源新生 RNA 与前体转录本。 

优势对比：CB RNA‑seq 实验流程更简单，不需要 Br‑UTP 标记，成本更低；但分辨率弱于 GRO‑seq，不适合精细的 Pol II 暂停位点解析。

Q3：CB RNA‑seq 和 PRO‑seq 有什么区别？

PRO‑seq 同样属于核 run‑on 类技术，在 run‑on 反应中掺入生物素标记 NTP，实现单碱基精度定位活跃 RNA 聚合酶的 3’端位置，适合研究转录起始、Pol II 暂停、聚合酶精确定位。 CB RNA‑seq 不开展体外 run‑on，直接捕获染色质上内源 RNA，没有单碱基聚合酶位点分辨率；优势是保留细胞内源共转录剪接中间体，适合研究共转录 RNA 加工，实验操作门槛更低。 

简单理解： 

PRO‑seq：看聚合酶停在基因组哪一个碱基位置； 

CB RNA‑seq：看染色质上存在哪些新生 RNA 及其剪接中间产物。

Q4：CB RNA‑seq 和 SLAM‑seq 有什么区别？

SLAM‑seq 依靠活细胞 4sU 代谢标记，通过测序 T‑C 碱基转换区分新合成 RNA 与旧 RNA，可以做 Pulse 模式捕获新生 RNA，也可以 Pulse‑Chase 模式计算 RNA 半衰期、RNA 周转动力学，总 RNA 为输入，不依赖染色质分离。 CB RNA‑seq 不需要向活细胞加核苷类似物标记，依靠染色质组分分离富集新生转录本；只能获取转录早期、染色质锚定的 RNA，无法追踪 RNA 降解、不能计算半衰期，优势是可捕获共转录剪接中间体。 

简单理解： 

SLAM‑seq：区分 RNA “新旧”，擅长 RNA 合成‑降解全生命周期动力学； 

CB RNA‑seq：抓 “还挂在染色质上” 的 RNA，聚焦转录发生阶段与共转录加工。

Q5：CB RNA‑seq 和 ChIP‑seq 有什么区别？

ChIP‑seq 检测蛋白 / 组蛋白修饰在基因组 DNA 上的结合位置，例如 RNA 聚合酶、H3K27ac、转录因子，反映蛋白与 DNA 的静态结合。蛋白结合不等于转录一定发生。 CB RNA‑seq 检测染色质上结合的 RNA 分子，直接反映转录输出，可看到基因区域是否真实产生新生转录本。 二者经常联合分析：ChIP‑seq 告诉我们蛋白是否结合 DNA；CB RNA‑seq 告诉我们该位点是否真正发生转录、产生 RNA 产物。

Q6：CB RNA‑seq 可以研究哪些科学问题？适合与哪些技术联合？

CB RNA‑seq 适合： 

1）识别基因的新生转录活性，区分转录激活与稳态 mRNA 积累； 

2）研究共转录剪接，捕捉染色质上未完成剪接的 RNA 前体； 

3）识别部分活跃非编码 RNA、染色质上滞留的转录本； 

4）成本友好的新生 RNA 初筛，适合批量样本、药物 / 胁迫处理时间序列。

可联合分析：

• 搭配 ChIP‑seq/CUT&Tag：转录因子、组蛋白修饰与新生转录活性关联；

• 搭配 ATAC‑seq：染色质开放状态和真实转录输出对应；

• 搭配 GRO‑seq/PRO‑seq：把聚合酶定位信息和内源染色质 RNA 加工信息互相印证。

Q7：CB RNA‑seq、GRO‑seq、PRO‑seq、SLAM‑seq、普通 RNA‑seq 怎么快速选型？

• 只想看基因稳态表达、差异 mRNA：普通 RNA‑seq

• 需要单碱基分辨率、看 RNA 聚合酶精确位置、启动子暂停：PRO‑seq / GRO‑seq

• 研究 RNA 半衰期、RNA 周转、区分新旧 RNA：SLAM‑seq（Pulse‑Chase）

• 研究共转录剪接、新生转录活性，追求流程简单、成本可控：CB RNA‑seq

已发表文章

1. Zhu J, Liu M, Chen Y, et al. Co‑transcriptional and post‑transcriptional features revealed by chromatin‑bound RNA‑seq in soybean[J]. Frontiers in Plant Science, 2021,12:732102.

2. Liu M, Zhu J, Huang H, Chen Y, Dong Z*. Comparative analysis of nascent RNA sequencing methods and their applications in studies of co‑transcriptional splicing dynamics[J]. The Plant Cell, 2023, 35(12):4304‑4324.

转录图谱分析

通过在基因组范围内绘制转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TES）附近的信号强度分布图，评估基因在不同处理组中的转录动态变化情况。反映了基因转录RNA的状态，包括起始、暂停、延伸、终止等过程。

剪接图谱

CB RNA-seq项目中可鉴定到可变剪接位点，将剪接位点前后的信号可视化显示为剪接图谱。

内含子保留分析

CB RNA-seq能够检测到没有被剪切的内含子，项目统计了每一个内含子在测序数据中的保留率，并分析不同组件内含子保留率差异。

可变剪接事件分析

将可变剪接分为4类，并统计每组样本中各种分类的数量，比较组间差异。

增强子鉴定及差异分析

对增强子进行鉴定，确定其在不同样本中的表达活性，并通过图表展现。

差异基因启动子区域-差异增强子区域的联合Motif分析

根据差异基因启动子区域和差异增强子区域的Motif分析结果，筛选显著富集的转录因子并集，并使用热图进行富集程度的可视化。

转录因子-增强子-靶基因网络分析

将转录因子、增强子、靶基因的调控关系进行分析，构建“转录因子—增强子—靶基因”调控网络，筛选其中高置信调控关系，形成可视化网络图。

CB‑RNA‑seq 解析拟南芥共转录剪接的特征与调控

期刊：Molecular Plant 

研究目的：动物与酵母中已广泛报道共转录剪接（CTS），但植物全基因组水平的共转录剪接特征、调控规律尚不明确。本研究利用CB‑RNA‑seq（染色质结合 RNA 测序）解析拟南芥幼苗中共转录剪接的全局特征，鉴定调控共转录剪接的 RNA 结合蛋白，揭示植物转录与剪接耦合的分子机制。

实验设计：以拟南芥 Col‑0 野生型、rz‑1b rz‑1c 双突变体为材料；分离细胞核，经尿素严谨洗涤提取染色质结合 RNA 开展CB‑RNA‑seq，同时做普通 mRNA‑seq 作为对照；采用 eCLIP‑seq 鉴定 RZ‑1C 在体内的 RNA 结合靶位点；结合公共组蛋白修饰 ChIP‑seq 数据分析染色质环境与共转录剪接效率关联；通过 5'SS/3'SS 比值定量共转录剪接效率，结合 qPCR、RIP‑qPCR 开展分子验证。

主要结果：

1. 证实拟南芥基因组广泛发生共转录剪接：CB‑RNA‑seq 可捕获染色质上新生延伸 RNA，呈现基因 5'→3' 覆盖度下降、外显子高覆盖内含子低覆盖的锯齿特征；拟南芥大量可变剪接的剪接抉择发生在染色质共转录阶段，并非全部转录完成后才进行剪接加工。

2. 挖掘植物共转录剪接独特调控特征：共转录剪接效率与基因表达量、组蛋白激活修饰（H3K4me3、H3K9ac）相关；独立于基因长度，基因内含子 / 外显子数目是共转录剪接效率的关键影响因子；距离内含子 3' 端到基因 polyA 位点的距离同样影响剪接效率，支持转录‑剪接的动力学耦合模型。

3. 鉴定 hnRNP 类蛋白 RZ‑1B/RZ‑1C 为全局共转录剪接增强因子：rz‑1b rz‑1c 突变体中数千个基因的染色质层面共转录剪接效率显著下降，但成熟 mRNA 水平剪接缺陷并不明显，提示 RZ‑1 蛋白主要作用于染色质上的共转录剪接阶段，转录后阶段可补偿完成内含子去除。

4. eCLIP‑seq 证明 RZ‑1C 通过直接结合 RNA 发挥功能：RZ‑1C 优先结合外显子序列，也可结合内含子；可通过局部（结合受调控剪接单元附近）、全局（结合远端外显子 / 内含子）两种模式促进多外显子基因的共转录剪接，不需要每个受影响内含子附近都有蛋白结合位点。

参考文献：

1. Zhu D, Mao F, Tian Y,et al. The Features and Regulation of Co‑transcriptional Splicing in Arabidopsis [J]. Molecular Plant,2020,13 (2):278‑294。